曼地亚红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇条件优化研究

2015-12-15

本试验以实验室中经过5次以上继代且生长稳定的曼地亚红豆杉愈伤组织为材料,采用单因素试验和正交试验的方法进行试验。研究曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的培养条件、蔗糖浓度、初始培养浓度、植物生长调节物质和防褐化物质对细胞生长的影响;天然添加物对曼地亚红豆杉细胞生长和细胞内紫杉醇含量的影响;碳源对曼地亚红豆杉细胞生长和细胞内紫杉醇含量的影响;诱导物质对曼地亚红豆杉细胞内紫杉醇含量的影响。通过上述试验,来获得最佳的培养基配方,筛选出最优的防褐化试剂配比,通过培养条件的确立,建立稳定的曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系;研究天然添加物在曼地亚红豆杉细胞悬浮培养过程中,对曼地亚红豆杉细胞生长和细胞内紫杉醇含量的影响,获得了最佳的天然添加物种类和添加浓度;通过碳源对曼地亚红豆杉细胞生长和细胞内紫杉醇含量影响的研究,来确定最适的碳源种类和浓度及其添加时间;通过对诱导物质对曼地亚红豆杉细胞生长和细胞内紫杉醇含量影响的研究,来确定最佳诱导物质配比和添加时间。通过这些研究,来建立稳定的悬浮培养体系和诱导生产紫杉醇的方法,为之后的大规模培养提供基础。试验的结果如下:1.曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系:通过对不同蔗糖浓度、接种量、植物生长调节物质组合和防褐化试剂配比对曼地亚红豆杉细胞生长的影响研究,通过单因素试验和正交试验进行筛选,确定曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的条件:B5培养基+2.4-D0.6mg/L+NAA0.8mg/L+KT1.0mg/L+柠檬酸0.22g/L+PVP0.35g/L+水解乳蛋白0.45g/L+蔗糖30g/L、pH=5.8、接种量0.1g/mL、培养箱转速110r/min、25℃、暗培养、继代时间为15d。2.天然添加物对曼地亚红豆杉细胞的影响:以香蕉汁、马铃薯汁、苹果汁3种天然添加物为材料。通过试验发现,3种天然添加物对红豆杉细胞生长和细胞内紫杉醇含量均有影响,其中以75g/L马铃薯汁对红豆杉细胞的增殖的影响最大,并且其对细胞内紫杉醇含量也具有显著的提高作用。3种天然物质对愈伤组织增殖的影响从大到小依次为:马铃薯汁、香蕉汁、苹果汁。而3种天然物质对红豆杉细胞中的紫杉醇含量的作用从大到小依次为:苹果汁、马铃薯汁、香蕉汁。3.碳源物质对曼地亚红豆杉细胞的影响:以蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、75%蔗糖+25%果糖、75%果糖+25%山梨醇和75%蔗糖+25%山梨醇10种碳源物质为材料进行试验,通过单因素试验确定最佳的碳源种类和添加浓度。对曼地亚红豆杉悬浮细胞生长和细胞内紫杉醇含量影响最大的碳源种类为蔗糖,其最适的浓度为40g/L,添加时间为在开始培养时添加蔗糖的浓度为30g/L,在培养到第15d时再添加10g/L的蔗糖。试验中发现多糖类物质对细胞生长的促进作用比单糖类和醇类物质要大,在对细胞的紫杉醇含量影响方面,醇类的影响作用较大,但是醇类物质不能支持细胞的生长。4.诱导物质对曼地亚红豆杉细胞的影响:以硝酸银、乙酸钠、水杨酸、苯丙氨酸和甘氨酸5种试剂为诱导物质,通过单因素和正交试验来确定曼地亚红豆杉细胞生产紫杉醇的最佳诱导配比为:硝酸银3mg/L+乙酸钠4mg/L+水杨酸15mg/L+苯丙氨酸10mg/L+甘氨酸10mg/L,添加诱导物质的时间为培养的第18d。5种诱导物质对曼地亚红豆杉细胞产紫杉醇的影响从大到小依次为:苯丙氨酸、甘氨酸、硝酸银、乙酸钠、水杨酸。5.对研究的结果进行验证,验证试验的结果为:曼地亚红豆杉悬浮培养细胞的增殖倍数为3.21;其紫杉醇含量为93.57μg/mL。

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